Atividade antimicrobiana do extrato de Psidium guajava L. (goiabeira) e sinergismo com antimicrobianos convencionais

Ana Luiza Ribeiro Aguiar; Hilania Valéria Dodou; Gleilton Weyne Passos Sales; Matheus Lima Rodrigues; Mary Anne Medeiros Bandeira; Nádia Accioly Pinto Nogueira

Atividade antimicrobiana do extrato de Psidium guajava L. (goiabeira) e sinergismo com antimicrobianos convencionais

Artículo original

Atividade antimicrobiana do extrato de Psidium guajava L. (goiabeira) e sinergismo com antimicrobianos convencionais

Actividad antimicrobiana del extracto de Psidium guajava L. (guayaba) y sinergismo con antimicrobianos convencionales

Antimicrobial activity of Psidium guajava L. (guava) extract and synergy with conventional antimicrobials

Ana Luiza Ribeiro Aguiar¹ ORCID: https://orcid.org/0000-0001-9587-8067
Hilania Valéria Dodou^2* ORCID: https://orcid.org/0000-0002-5507-2795
Gleilton Weyne Passos Sales² ORCID: https://orcid.org/0000-0003-1721-0912
Matheus Lima Rodrigues² ORCID: https://orcid.org/0000-0002-6802-6843
Mary Anne Medeiros Bandeira³ ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0550-8308
Nádia Accioly Pinto Nogueira⁴ ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0489-9108

¹Departamento de Biomedicina. Universidade Federal do Ceará Fortaleza, Ceará, Brasil.
²Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, Ceará, Brasil.
³Departamento de Farmácia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, Ceará, Brasil.
⁴Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, Ceará, Brasil.

*Autora pela correspondência: valeriadodou@gmail.com.

RESUMO

Introdução: Psidium guajava L. (Myrtaceae), conhecida como goiabeira, é uma planta muito utilizada popularmente na forma de chá das folhas jovens (brotos), para o tratamento de enfermidades, como infecções do trato gastrointestinal.
Objetivos: Avaliar a atividade antimicrobiana do extrato hidroalcoólico das folhas maduras de P. guajava assim como seu potencial modulador sobre a ação de antibióticos comerciais.
Métodos: O potencial antimicrobiano do extrato hidroalcoólico das folhas maduras de P. guajava foi determinado sobre as cepas Staphylococcus aureus ATCC 6538P, Escherichia coli ATCC 10536, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Salmonella choleraesuis ATCC 10708 e Candida albicans ATCC 10231, utilizando os métodos de difusão em ágar e de microdiluição em caldo de cultura. Foi utilizada a técnica de difusão em ágar para avaliação do efeito modulador do extrato sobre os fármacos gentamicina, cefoxitina, ciprofloxacino e amicacina.
Resultados: Testes fitoquímicos mostraram que o extrato apresentou flavonóides, taninos pirogálicos, saponinas e triterpenóides. O extrato inibiu o crescimento de 60 % (n=3) das cepas, apresentando melhor ação sobre P. aeruginosa ATCC 9027 es. choleraesuis ATCC 10708, com concentração inibitória mínima igual a 5mg/mL para ambas as cepas. A maioria das associações foi aditiva (n=7; 58,33 %), mas destaca-se o importante sinergismo encontrado na associação com ampicilina sobre P. aeruginosa ATCC 9027 e S. choleraesuis ATCC 10708, com reduçãoda resistência destas cepas ao fármaco.
Conclusão: Portanto, o extrato das folhas maduras de P. guajava possui boa ação antimicrobiana que deve continuar sendo investigada, além de potencializar a ação de fármacos convencionais, restaurando sua eficácia sobre cepas de importância clínica.

Palavras-chave: Psidium guajava; anti-infecciosos, produtos biológicos; sinergismo farmacológico.

RESUMEN

Introducción: Psidium guajava L. (Myrtaceae), conocida como guayaba, es una planta popularmente utilizada en forma de té de hojas jóvenes (brotes) para el tratamiento de infecciones del tracto gastrointestinal.
Objetivos: Evaluar la actividad antimicrobiana del extracto hidroalcohólico de las hojas maduras de P. guajava, así como su posible efecto sobre la acción de los antibióticos comerciales.
Métodos: Se determinó el potencial antimicrobiano de las hojas maduras deP. guajava en cepas de Staphylococcus aureus ATCC 6538P, Escherichia coli ATCC 10536, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Salmonella choleraesuis ATCC 10708 y Candida albicans ATCC 10231 mediante los métodos de difusión en agar y microdilución en caldo de cultivo. La técnica de difusión en agar se utilizó para evaluar el efecto modulador del extracto sobre los medicamentos gentamicina, cefoxitina, ciprofloxacina y amikacina.
Resultados: Las pruebas fitoquímicas mostraron que el extracto presentaba flavonoides, taninos pirogálicos, saponinas y triterpenoides. El extracto inhibió el crecimiento del 60 % (n = 3) de las cepas, mostró una mejor acción en P. aeruginosa ATCC 9027 y S. choleraesuis ATCC 10708 con una concentración inhibitoria mínima de 5 mg / mL para ambas cepas. La mayoría de las combinaciones fueron aditivas (n = 7, 58.33 %), pero s la combinación con ampicilina mostró una sinergia considerable en P. aeruginosa ATCC 9027 y S. choleraesuis ATCC 10708 con reducción de la resistencia de estas cepas a la droga vegetal.
Conclusiones: El extracto de las hojas maduras de P. guajava tiene una buena acción antimicrobiana que debe ser el objetivo de futuras investigaciones. Además de potenciar la acción de los fármacos convencionales, el extracto refuerza la eficacia de estos productos sobre cepas de importancia clínica.

Palabras clave: Psidium guajava; antiinfecciosos; productos biológicos; sinergismo farmacológico.

ABSTRACT

Introduction: Psidium guajava L. (Myrtaceae), known as guava, is a plant commonly used in the form of tea of young leaves (shoots) to treat gastrointestinal infections.
Objectives: Evaluate the antimicrobial activity of the hydroalcoholic extract of mature P. guajava leaves, as well as its potential effect upon the action of commercial antibiotics.
Methods: Determination was performed of the antimicrobial potential of P. guajava mature leaves against strains of Staphylococcus aureus ATCC 6538P, Escherichia coli ATCC 10536, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Salmonella choleraesuis ATCC 10708 and Candida albicans ATCC 10231 by the agar diffusion test and broth culture microdilution. The agar diffusion technique was used to evaluate the modifying effect of the extract upon the drugs gentamicin, cefoxitin, ciprofloxacin and amikacin.
Results: Phytochemical tests found that the extract contained flavonoids, pyrogallic tannins, saponins and triterpenoids. The extract inhibited growth in 60 % (n = 3) of the strains, displaying better activity in P. aeruginosa ATCC 9027 and S. choleraesuis ATCC 10708, with a minimum inhibitory concentration of 5 mg/ml for both strains. Most combinations were additive (n = 7, 58.33%), but the combination with ampicillin displayed considerable synergy in P. aeruginosa ATCC 9027 and S. choleraesuis ATCC 10708, reducing the resistance of these strains to the plant drug.
Conclusions: The extract of P. guajava mature leaves was found to display good antimicrobial activity which should be the object of further research. The extract also boosts the action of conventional drugs, reinforcing their efficacy against strains of clinical importance.

Key words: Psidium guajava, anti-infectives, biological products, drug synergy.

Recibido: 19/02/018
Aprobado: 09/11/2018

INTRODUÇÃO

A espécie Psidium guajava L. (Myrtaceae) está presente em todas as regiões do Brasil e é conhecida popularmente como goiabeira-vermelha, goiabeira-branca, araçá-goiaba, araçá-das-almas, araçaíba, goiaba-maça, dentre outras denominações.⁽¹⁾ Suas folhas, brotos, cascas, raízes e flores são usadas na preparação de chás, infusões, decocções, extratos, pastas ou colocados aquecidos diretamente sobre a pele. É utilizada na medicina popular para tratamento de distúrbios respiratórios, diabetes, hipertensão, bem como com funções analgésica, antipirética, antiinflamatória, cicatrizante e antimicrobiana.^(2,3)

A utilização de preparações a partir dos brotos de P. guajava com fins antimicrobianos é comum na medicina popular principalmente no tratamento de infecções relacionadas ao trato gastrointestinal.^(4,5,6) Apesar disso, o potencial antimicrobiano de preparações a partir de folhas maduras é pouco estudado. Como os brotos estão em pequena quantidade na planta, investigar o potencial antimicrobiano das folhas maduras assume grande importância, pois estas são encontradas em maior quantidade, o que facilita o acesso à população e preserva o vegetal.

Diante da crescente resistência microbiana evidente nas últimas décadas, a busca por novas substâncias com potencial antimicrobiano é essencial.⁽⁷⁾ Combinação entre produtos derivados de plantas e fármacos antimicrobianos convencionais é uma estratégia promissora, pois pode aumentar a eficácia dos agentes antimicrobianos no tratamento de infecções por microrganismos multirresitentes.⁽⁸⁾ O efeito modulador de diferentes extratos de P. guajava na ação de antimicrobianos é pouco relatado na literatura, com estudos sobre sinergismo com o antifúngico fluconazol sobre espécies de Candida sp. e com antibióticos sobre cepas de Staphylococcus aureus isoladas clinicamente.^(9,10,11)

Diante disso, o estudou objetivou investigar o potencial antimicrobiano de folhas maduras de P. guajava sobre bactérias e leveduras, assim como avaliar seu potencial de modular sinergicamente a ação de fármacos antibióticos já disponíveis comercialmente sobre bactérias Gram positivo e negativo de importância clínica.

MÉTODOS

Material botânico

Folhas maduras de Psidium guajava L. (Myrtaceae) foram coletadas do Horto de Plantas Medicinais Professor Francisco José de Abreu Matos da Universidade Federal do Ceará (UFC). A identificação botânica da espécie foi realizada no Departamento de Biologia da UFC e a exsicata foi depositada no Herbário Prisco Bezerra (UFC, Fortaleza, Ceará, Brasil) sob o número 57888.

Obtenção do extrato hidroalcoólico de P. guajava

Após coleta, as folhas maduras de P. guajava foram secas e estabilizadas em estufa de ar circulante a 45 °C. Em seguida, o material foi triturado em moinho de facas e deixado sob maceração por três dias, em etanol 70 %. O extrato foi esterilizado por filtração em membrana filtrante e concentrado em estufa de secagem a 30°C, por três dias.⁽¹⁾ O rendimento da extração foi de 16,7 %.

Análise fitoquímica do extrato hidroalcoólico de P. guajava

A análise fitoquímica do extrato hidroalcoólico de P. guajava foi realizada conforme recomendado por Matos¹. Para isso, 3ml e 10 ml do extrato foram adicionados a tubos de ensaio e béqueres, respectivamente. Os extratos foram deixados em banho-maria até secura e mantidos em dessecador até serem usados. Foram realizados os testes fitoquímicos para avaliar a presença de flavonóides, taninos, alcalóides, saponinas, heterosides digitálicos, antocianinas e o teste de Lieberman-Burchard.

Determinação da atividade antimicrobiana do extrato hidroalcoólico de P. guajava

Cepas microbianas

Para os ensaios de atividade antimicrobiana foram utilizadas cinco cepas de referência: Staphylococcus aureus ATCC 6538P, Escherichia coli ATCC 10536, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Salmonella choleraesuis ATCC 10708 e Candida albicans ATCC 10231. Estas cepas foram obtidas da Coleção de Microrganismos de Referência em Vigilância Sanitária - CMRVS, FIOCRUZ-INCQS, Rio de Janeiro.

Determinação do potencial antimicrobiano

A determinação do potencial antimicrobiano do extrato hidroalcoólico de P. guajava foi realizada conforme o método de Difusão em Agar modificado.⁽¹²⁾

Culturas microbianas puras foram repicadas em caldoBrain Heart Infusion (BHI, MercK), incubadas a 37 °C, overnight. A densidade celular foi ajustada em solução salina 0,85 % estéril para se obter turbidez equivalente ao tubo 0,5 da escala de McFarland (cerca de 1,5 x 10⁸ UFC/mL). Com auxílio de swab estéril, a suspensão microbiana foi semeada na superfície de ágar Mueller-Hinton (Merck) ou ágar Sabouraud (Merck), para bactérias e levedura, respectivamente.

Foram feitos poços de 6 mm de diâmetro interno no ágar com auxílio de perfurador estéril. Nesses poços foram colocados 40mL das diferentes concentrações (200 a 25 mg/mL) do extrato hidroalcoólico de P. guajava. As placas foram incubadas a 37 °C por 24 h e foi observada a formação de halos de inibição (HI) do crescimento microbiano. Os diâmetros dos halos formados foram medidos em milímetros. A técnica de difusão em ágar foi utilizada como triagem na determinação do potencial antimicrobiano.

Determinação da Concentração Inibitória Mínima - CIM

A determinação da CIM foi realizada pelo método de microdiluição em caldo de cultura⁽¹³⁾ para as cepas que apresentaram sensibilidade no ensaio de difusão em ágar. Em microplacas de 96 poços foram adicionados 100 mL de caldo BHI, 20 mL das diferentes concentrações do extrato (40mg/mL a 0,019 mg/mL) e 80 mL de suspensão microbiana (10⁶UFC/mL). As microplacas foram incubadas a 37 °C por 24 horas. Foi adicionado sal de resazurina e realizada inspeção visual. A CIM foi considerada a menor concentração do extrato hidroalcoólico de P. guajava capaz de inibir completamente o crescimento microbiano.

Efeito modulador do extrato hidroalcoólico de P. guajava na ação de antibióticos convencionais

Foi determinado o potencial modulador do extrato hidroalcoólico de P. guajava na ação dos antibióticos gentamicina (GEN, 30µg), cefoxitina (CFO, 30µg), ciprofloxacina (CIP, 5µg), ampicilina (AMP, 10µg), sobre as cepas P. aeruginosa ATCC 9027, S. choleraesuis ATCC 10708 e S. aureus ATCC 6538P. O ensaio foi realizado pelo método de disco-difusão modificado.⁽¹⁴⁾

Culturas microbianas (com aproximadamente 1,5 x 10⁸ UFC/mL) foram semeadas na superfície de ágar Mueller Hinton. Discos comerciais (Aldrich Co. LLC) de agentes antimicrobianos (ATM) foram colocados na superfície do meio de cultura e sobre cada disco foram adicionados 20 μL do extrato em concentração igual a CIM. As placas foram incubadas a 37 °C por 24h e foi realizada a leitura dos diâmetros dos halos de inibição (HI).

O HI de crescimento microbiano determinado por cada associação entre extrato hidroalcoólico de P. guajava e fármaco antimicrobiano (HI EHPg-ATM) foi comparado ao HI determinado pela ação do ATM isoladamente (HI ATM).

Foi considerado:⁽¹⁵⁾

Efeito antagônico: HI EHPg-ATB < HI

Efeito indiferente: HI ATB + 2,0mm > HI EHPg-ATB ≥ HI ATB

Efeito sinérgico: HI EHPg-ATB ≥ HI ATB + 2,0mm;

Análise estatística

Os experimentos foram realizados em triplicata e os resultados foram expressos como Média + Erro Padrão da Média (EPM). Utilizando o programa GraphPad Prism 6, foi realizada análise de variância (ANOVA) e pós-teste de Tukey para comparar as médias dos diferentes tratamentos, e foi considerado estatisticamente significante quando p < 0,05.

RESULTADOS

Análise fitoquímica do extrato hidroalcoólico de P. guajava

A análise fitoquímica do extrato hidroalcoólico de P. guajava revelou a presença das classes químicas flavonóides, taninos pirogálicos, saponinas e triterpenóides (Tabela 1).

Atividade antimicrobiana do extrato hidroalcoólico de P. guajava

Pela técnica de difusão em ágar, o extrato hidroalcoólico de P. guajava mostrou bom potencial antimicrobiano sobre bactérias Gram positivo e negativo, com destaque para S.cholereasuis ATCC 10708 e P. aeruginosa ATCC 9027 , entretanto não apresentou ação sobre leveduras (Tabela 2).

Controles de inibição: Gentamicina 10 μg/mL (para bactérias) e Miconazol 32μg/mL (para levedura).

Pela técnica de microdiluição em caldo de cultura, o extrato hidroalcoólico de P. guajava apresentou melhor ação sobre as cepas Gram negativo S. cholereasuis ATCC 10708e P. aeruginosa ATCC 9027 (Tabela 3).

Efeito modulador do extrato hidroalcoólico de P. guajava na atividade de antimicrobianos de uso clínico

A maior parte das associações foram aditivas (n= 7; 58,33 %), incluindotodas as associações com os fármacos cefuroxima e ciprofloxacino. Foram observadas duas (16,67 %) importantes associações sinérgicas com ampicilina sobre S. cholereasuis ATCC 10708e P. aeruginosa ATCC 9027 (Tabela 4).

DISCUSSÃO

A análise fitoquímica qualitativa identificou a presença de flavonóides, taninos pirogálicos, saponinas e triterpenóides no extrato hidroalcoólico de P. guajava. Diversos outros estudos têm mostrado como principais constituintes, presentes no gênero Psidium, os taninos, flavonóides e saponinas, além de alcoóissesquiterpenóides.^(16,17,18)

Em estudo com extratos hidroalcoólicos de folhas frescas e secas do gênero Psidium, foi observada a presença de taninos, saponinas, antraderivados e traços de alcalóides, entretanto, não se encontrou flavonóides. Já está bem elucidada a variação na composição química de extratos e óleos essenciais de plantas conforme o local e a época da coleta, dentre outros fatores, o que justifica essas diferenças apresentadas.⁽¹⁹⁾

Os constituintes isolados presentes no extrato hidroalcoólico de P. guajava apresentam potencial antimicrobiano relatado na literatura. Os taninos são compostos polifenólicos com capacidade de inibir microrganismos e seus fatores de virulência, além de agirem sinergicamente com antibióticos.^(20,21) Os flavonóides também são metabólitos polifenólicos, que tem ação sobre diferentes microrganismos por três mecanismos principais: degradação da membrana plasmática das bactérias,⁽²²⁾ inibição de ácidos nucléicos⁽²³⁾e inibição da síntese de energia (ATP).⁽²⁴⁾ Os efeitos antimicótico e antibacteriano dos triterpenóides foi relatado,⁽²⁵⁾ assim como a ação inibitória de saponinas sobre bactérias Gram positivo, especialmente S. aureus.⁽²⁶⁾

Estudo anterior avaliou a ação antibacteriana de extrato aquoso, etanólico, metanólico e hexânico de folhas de P. guajava sobre cepas Gram positivo e negativo, e mostrou que apenas os extratos etanólico e metanólico apresentaram boa atividade, inibindo o crescimento somente de bactérias Gram positivo.⁽²⁶⁾ Bona et al.,⁽²⁷⁾ por sua vez, mostraram que extratos aquoso e alcoólico de folhas de P. guajava não tem atividade sobre leveduras, mas apresentam potencial antimicrobiano sobre bactérias Gram positivo (com CIM variando de 6,25 a 100 mg/mL), e melhor ação sobre bactérias Gram negativo (0,39 a 25 mg/mL). As variações na constituição química dos extratos, conforme relatados anteriormente, justificam essas diferentes ações.

No presente estudo, o teste de difusão em ágar mostrou o bom efeito antibacteriano do extrato hidroalcoólico de P. guajava tanto sobre cepas Gram positivo, como sobre Gram negativo, mas com melhor ação sobre S. choleraesuis e P. aeruginosa.

Pelo ensaio de determinação da CIM, o extrato hidroalcoólico de P. guajava inibiu o crescimento de S. aureus (CIM = 20mg/mL), mas apresentou melhor ação bacteriostática sobre P. aeruginosa e S. choleraesuis, com valores menores de CIM (5mg/mL). O potencial dos compostos isolados citados anteriormente pode justificar a ação antimicrobiana do extrato hidroalcoólico de P. guajava encontrada no presente estudo, considerando também o possível efeito sinérgico, decorrente da associação de todos esses compostos no extrato.^{(20,21,22,23,24,25,26)}

O crescente surgimento de cepas bacterianas resistentes aos fármacos tem chamado a atenção de pesquisadores e órgãos internacionais para a busca por novas alternativas terapêuticas para o tratamento de doenças infecciosas. Conforme publicação da lista de patógenos prioritários para a pesquisa e desenvolvimento de novos antibióticos, pela Organização Mundial da Saúde,⁽²⁸⁾ P. aeruginosa é uma bactéria de prioridade crítica (prioridade nível 1), enquanto Salmonella spp. e S. aureus são de prioridade alta (prioridade nível 2). Diante disso, é importante a boa ação do extrato hidroalcoólico de P. guajava sobre tais cepas, demonstradas no presente estudo, e tal atividade deve continuar sendo investigada, especialmente sobre P. aeruginosa.

Uma estratégia para potencializar a ação de extratos vegetais, assim como de reverter a resistência de tais cepas aos antibióticos que já se tem no mercado, é associar esses produtos naturais com os fármacos de uso clínico, buscando interações que sejam sinérgicas.^(29,30)

A avaliação do efeito modulador do extrato hidroalcoólico de P. guajava sobre fármacos das classes aminoglicosídeos, penicilinas, cefalosporinas e quinolonas, apresentou majoritariamente efeito aditivo, mas destaca-se o sinergismo observado na interação entre o extrato e o fármaco ampicilina, sobre P. aeruginosa e S. choleraesuis. Estas interações foram importantes e significativas visto que as duas cepas eram resistentes ao fármaco isolado, mostrando que o extrato hidroalcoólico de P. guajava reverteu tal resistência.

É importante destacar que as interações sinérgicas, quando ocorrem em concentrações inferiores à CIM, além de aumentarem a ação antimicrobiana das substâncias isoladas, garantindo a eficácia sobre cepas anteriormente resistentes, podem reduzir a toxicidade do fármaco, visto que as concentrações necessárias para obtenção do efeito são menores.⁽³¹⁾

O presente estudo demonstra a boa atividade do extrato obtido a partir de folhas maduras de P. guajava sobre bactérias, especialmente sobre as cepas Gram negativo P. aeruginosa e S. choleraesuis, além da sua capacidade de modular sinergicamente a ação da ampicilina sobre estas cepas. Propõe-se que estudos que investiguem o mecanismo de ação e a toxicidade do extrato hidroalcoólico de P. guajava, sozinho e associado à ampicilina, sejam realizados afim de demonstrar que esta espécie é promissora para o desenvolvimento de um fármaco antimicrobiano que sirva como nova alternativa terapêutica.

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Contribución de los autores

Ana Luiza Ribeiro Aguiar^:Participação na obtenção do material botânico, obtenção e análise fitoquímica do extrato de P. guajava.

Hilania Valéria Dodou^:Realização dos ensaios de atividade antimicrobiana e sinergismo, análise dos resultados e redação do artigo científico.

Gleilton Weyne Passos Sales: Realização dos ensaios de atividade antimicrobiana e sinergismo.

Matheus Lima Rodrigues: Realização dos ensaios de atividade antimicrobiana e sinergismo.

Mary Anne Medeiros Bandeira: Participação na obtenção do material botânico, obtenção e análise fitoquímica do extrato de P. guajava.

Nádia Accioly Pinto Nogueira:Orientação da pesquisa, análise dos resultados e redação do artigo científico.

Conflicto de intereses

Los autores expresan que no tienen conflicto de intereses.