Actividad antibacteriana y antioxidante del extracto etanólico de las hojas de Prosopis pallida (algarrobo)

ARTÍCULO ORIGINAL

 

Actividad antibacteriana y antioxidante del extracto etanólico de las hojas de Prosopis pallida (algarrobo)

 

Antibacterial and antioxidant activity of ethanolic extract from leaves of Prosopis pallida leaves (American carob)

 

 

Cynthia Cardenas Camacho,I Julio Ruiz Quiroz,II Américo Castro Luna,I Norma Ramos Cevallos,I Juan Rojas Armas,III Donald Ramos PerfectoIV

I Instituto de Investigación en Ciencias Farmacéuticas y Recursos Naturales "Juan de Dios Guevara", Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Perú.
II Instituto de Investigación en Química Biológica, Microbiología y Biotecnología, "Marco Antonio Garrido Malo", Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Perú.
III Instituto de Investigaciones Clínicas, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Perú.
IV Facultad de Odontología, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Perú.

 

 


RESUMEN

Introducción: En la medicina tradicional peruana se utiliza Prosopis pallida (algarrobo) para tratar la tos, la bronquitis, el dolor de estómago y las heridas graves; sin embargo, existen escasos estudios sobre la actividad farmacológica de esta planta.
Objetivo: Determinar la actividad antibacteriana y antioxidante del extracto etanólico de las hojas de Prosopis pallida contra Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 8739, Bacillus subtilis ATCC 6633 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
Métodos: El extracto etanólico (etanol 96º) se obtuvo mediante maceración a partir de 350 g de hojas. Los metabolitos secundarios presentes en el extracto se determinaron utilizando pruebas específicas de coloración y precipitación. El contenido total de polifenoles se determinó mediante el método de Folin Ciocalteu; la actividad antibacteriana, con el método de difusión en agar y su concentración mínima inhibitoria, con el método de dilución colorimétrica en microplaca. La actividad antioxidante se evaluó mediante los métodos del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) y el radical catiónico 2,2'-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico) (ABTS).
Resultados: En la marcha fitoquímica se determinó la presencia de compuestos fenólicos, flavonoides y taninos. El contenido de fenoles totales fue de 8,39 mg/Eq de ácido gálico/g de extracto seco. El extracto etanólico de las hojas de Prosopis pallida presentó actividad antimicrobiana contra Staphylococcus aureus ATCC 25923 con halos de inhibición de 18,1 ± 1,2 mm y una concentración mínima inhibitoria (CMI) de 1 000 µg/mL, la actividad antioxidante presentó una concentración media inhibitoria (IC 50) de 456,8 ± 1,5 µg/mL y 470,2 ± 2,6 µg/mL en los ensayos de DPPH Y ABTS, respectivamente.
Conclusiones: Se demostró el potencial antimicrobiano y antioxidante del extracto etanólico de Prosopis pallida.

Palabras clave: Prosopis pallida; algarrobo; polifenoles; antibacteriano; antioxidante.


ABSTRACT

Introduction: Prosopis pallida (American carob) is used in Peruvian folk medicine to treat coughing, bronchitis, stomach ache, and serious injuries. However, few studies have been conducted about the pharmacological activity of this plant.
Objective: Determine the antibacterial and antioxidant activity of ethanolic extract from Prosopis pallida leaves against Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 8739, Bacillus subtilis ATCC 6633 and Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
Methods: The ethanolic extract (ethanol 96%) was obtained by maceration of 350 g of leaves. The secondary metabolites in the extract were determined by specific colorimetric and precipitation testing. Total polyphenolic content was determined by Folin-Ciocalteu assay, antibacterial activity by agar diffusion testing, and minimum inhibitory concentration by microplate colorimetric dilution. Antioxidant activity was evaluated with the methodologies for radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) and cationic radical 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid (ABTS).
Results: Phytochemical analysis revealed the presence of phenolic compounds, flavonoids and tannins. Total phenolic content was 8.39 mg eq. of gallic acid / g of dry extract. The content of total phenols was 8.39 mg/Eq of gallic acid/g of dry extract. The ethanolic extract from Prosopis pallida leaves displayed antimicrobial activity against Staphylococcus aureus ATCC 25923 with inhibition haloes of 18.1 ± 1.2 mm and a minimum inhibitory concentration (MIC) of 1000 μg/ml. Antioxidant activity showed a mean inhibitory concentration (IC50) of 456.8 ± 1.5 µg/ml and 470.2 ± 2.6 µg/ml by DPPH and ABTS, respectively.
Conclusions: The ethanolic extract of Prosopis pallida was found to have antimicrobial and antioxidant potential.

Key words: Prosopis pallida, American carob, polyphenols, antibacterial, antioxidant.


 

 

INTRODUCCIÓN

Prosopis pallida (Humboldt & Bompland ex Willadenow) H.B.K. (familia Mimosaceae), conocido con los nombres vulgares algarrobo, huarango o guarango, es una leguminosa arbórea que crece en las zonas áridas y semiáridas de Perú, tiene gran resistencia a la sequía y a la salinidad, sus frutos son vainas rectas o algo curvadas de 16 a 28 cm de largo con contenidos elevados de proteínas, hidratos de carbono, minerales, taninos y polifenoles.1 Esta planta fue llevada desde Sudamérica a regiones en Oceanía, Asia, y África a principios del siglo XIX.2 Se han mencionado dos productos del algarrobo para uso industrial: la algarrobina y la harina de algarroba; la algarrobina es un concentrado del azúcar del fruto ampliamente utilizado como edulcorante y saborizante.3

En la medicina tradicional peruana, el algarrobo es utilizado para tratar la tos, la bronquitis, el dolor de estómago y las heridas graves,4 y son los compuestos fenólicos como flavonoides y taninos los responsables de su uso medicinal.5 Sin embargo, existen escasos estudios sobre la actividad farmacológica del algarrobo. Se ha informado que el extracto acuoso de algarrobo inhibe la α-glucosidasa y la enzima convertidora de angiotensina (ECA), lo cual garantiza su administración para el tratamiento complementario de la diabetes mellitus de tipo 2 y de la hipertensión.6

Los compuestos fenólicos constituyen uno de los grupos más numerosos y representativos de los metabolitos secundarios de las plantas, a dichos compuestos se les atribuyen propiedades antibacteriana y antioxidante según diversos estudios realizados in vitro.7 En la actualidad, los gobiernos y los consumidores están interesados en el estudio de las plantas medicinales y están empezando a considerar la importancia de la medicina natural para incorporarlas a la atención de salud que y promover su uso seguro y eficaz.8

La resistencia bacteriana a los antibióticos es cada vez mayor tanto en la comunidad como en el hospital con un notable impacto en las tasas de morbilidad y mortalidad y en la carga financiera asociada a estos factores.9 Esta grave situación está dando lugar a la necesidad de buscar otras estrategias o alternativas para combatir las infecciones causadas por microorganismos.7 Por otra parte, si bien la oxidación es fundamental para la vida, pues participa en los procesos de obtención de la energía celular, cuando el proceso de oxidación es excesivo aparece el llamado estrés oxidativo que es una realidad compleja en todos los sistemas biológicos y que se relaciona con muchas enfermedades y procesos como la aterosclerosis, el cáncer, la catarata senil, la insuficiencia renal, la diabetes mellitus, la hipertensión arterial, la cirrosis y la insuficiencia hepáticas, la artritis y la inflamación, la desmielinización, la amiloidosis, la colagenosis, la demencia senil, la displasia broncopulmonar, la enfermedad de Alzheimer, el distrés respiratorio del adulto, las mutaciones, la enfermedad de Parkinson, la isquemia cerebral, las miocardiopatías y la insuficiencia cardiaca, la muerte súbita cardiaca y el envejecimiento, entre otros.10 Asimismo, los efectos carcinogénicos que producen las sustancias sintéticas como el hidroxianisol butilado (BHA) o el hidroxitolueno butilado (BHT), los cuales atrapan eficientemente los radicales libres e incrementan la búsqueda de antioxidantes de origen natural.11

Sobre la base de estos antecedentes se evaluó la actividad antibacteriana del extracto etanólico de Prosopis pallida contraStaphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis y Pseudomonas aeruginosa, así como su actividad antioxidante in vitro.

 

MÉTODOS

Material vegetal

Se recolectó la planta en los campos de la ciudad costera de Chiclayo, Lambayeque, Perú. Se identificó y certificó en el Museo de Historia Natural de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos según el sistema de clasificación de Cronquist (1981).


Obtención del extracto etanólico

Para obtener el extracto etanólico de Prosopis pallida se emplearon las hojas seleccionadas, se secaron en una estufa a 40 °C y se trituraron. El extracto etanólico se obtuvo de 350 g de la muestra en 3 litros de etanol (96º) mediante maceración, filtración y desecación. Se obtuvo una masa viscosa negruzca.


Estudio fitoquímico

Para identificar los metabolitos secundarios se caracterizaron las reacciones químicas de coloración y precipitación: para los azúcares, la reacción Molish A y antrona; para los compuestos fenólicos, el tricloruro férrico; para los taninos, la gelatina; para los aminoácidos libres, la ninhidrina; para los flavonoides, la reacción de Shinoda y el sulfato de cerio; para los triterpenoides y esteroides, la reacción de Lieberman-Burchard; para las naftoquinonas, la reacción de Bortranger; para los alcaloides, los reactivos de Dragendorff, de Mayer y de Bertrand y para las saponinas, el agua.12,13


Determinación de los polifenoles totales

Se determinaron los polifenoles totales en el extracto etanólico de las hojas de Prosopis pallida con el reactivo de Folin-Ciocalteu (RFC) para medir la capacidad de reducir el ácido fosfomolibdico/fosfotungstico, en el cual el molibdeno se encuentra en estado de oxidación VI y es de color amarillo, y que al ser reducido en un medio básico por los compuestos fenólicos da un complejo de color azul intenso, y el estado de oxidación del metal cambia de VI a V susceptible a una determinación espectrofométrica a 765 nm. El resultado se expresó como mg/Eq de ácido gálico/g de extracto seco.14


Determinación de la actividad antimicrobiana

Método de difusión en agar

Esta prueba se basa en inhibir el crecimiento bacteriano mediante la difusión de las sustancias activas en un medio sólido y se caracteriza por la formación de halos claros alrededor de las colonias.

Las cepas trabajadas fueron Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 8739, Bacillus subtilis ATCC 6633 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.

Para preparar la suspensión de los inóculos se utilizaron los microorganismos sembrados en placas de agar tripticasa soya (TSA) y se incubaron a 37 °C de 18 a 24 h. Los microorganismos se suspendieron en una solución salina estéril al 0,9 % y se ajustó la turbidez equivalente al tubo Nº 0.5 (1,5 × 108 UFC/mL) de la escala de McFarland. Se mezclaron en condiciones asépticas 20 mL del agar Mueller-Hilton fundido (45 °C) con 100 µL de la suspensión del inóculo, luego se distribuyó la mezcla en las placas de Petri de vidrio estériles, se dejó solidificar y se rotuló con el nombre del microorganismo testigo.

Una vez que el agar solidificó se hicieron hoyos con un sacabocado de 11 mm de diámetro externo, se agregaron 100 µL del extracto (50 mg/mL y 100 mg/mL) a los pozos y las placas se incubaron por espacio de 24 h a 37 °C. Se usaron como control positivo el ciprofloxacino (50 µg/disco) y el DMSO como control negativo. Las pruebas se llevaron a cabo por triplicado. Se determinó la actividad antimicrobiana midiendo el diámetro (mm) del halo de inhibición con un vernier.15


Método de microdilución colorimétrico en microplaca

Este método se basa en inhibir el crecimiento bacteriano mediante la dilución de los extractos respectivos (sustancias activas) en un medio líquido, y así lo demuestra la ausencia de crecimiento en los pozos utilizando el indicador redox resazurina como marcador de bacterias vivas. Para esta prueba se diluyeron los extractos en dimetil sulfóxido (DMSO) en una concentración de 100 mg/mL. Se usaron cepas de Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 8739, Bacillus subtilis ATCC 6633 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Posteriormente se preparó el inoculo equivalente al tubo de 0,5 en la escala de McFarland (1,5 × 108 UFC/mL) y se realizó el procedimiento de acuerdo con el método modificado de Sarker y otros.16 Se utilizó una placa de poliestireno de 96 pozos de fondo plano y estériles.

Las muestras se prepararon en concentraciones de 3,91 a 2 000 µg/mL utilizando técnicas de dilución seriadas y se usó como control positivo el ciprofloxacino en concentraciones de 0,125 a 64 μg/mL usando también las técnicas de dilución seriada. En este método se incluyeron pozos de control del crecimiento (bacterias más caldo Mueller-Hinton), de control de la esterilidad (caldo Mueller-Hinton) y los de ensayo (bacterias más caldo Mueller-Hinton más antibiótico o extracto). Todas las pruebas se realizaron por triplicado.

Las muestras y los antibióticos se dispensaron en los pozos de las placas de microdilución a razón de 100 uL para cada uno en concentración 2 veces la concentración final deseada. Luego se adicionaron a cada pozo 100 µL del inóculo que ya tenía incorporado la solución indicadora de resazurina. Luego las placas fueron llevadas a incubación de 37 °C por espacio de 18 a 24 h. Los resultados se leyeron visualmente. Cualquier cambio de color de púrpura a rosado o a incoloro se registraron como positivos. La concentración más baja a la que no se produjo el cambio de color se tomó como el valor de la CMI. Se calculó el promedio de tres valores y se reportó como la CMI.16


Determinación de la actividad antioxidante

Método DPPH (2,2 -difenil-1- picrilhidrazil)

Se aplicó el método del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) que se basa en la reducción de la absorbancia medida a 517 ղm del radical DPPH mediante sustancias antioxidantes.17 Se preparó la solución de reserva de 40 mg/100 mL de 2,2 -difenil-1-picrilhidrazil (DPPH, Sigma) 1 mM en metanol. Se calibró el espectrofotómetro con un blanco que contiene 400 µL del solvente (metanol:etanol 4:1) de la muestra problema y 800 µL de metanol. A continuación se colocaron en un tubo de ensayo 400 µL de la muestra en concentraciones de 0, 50, 200, 350, 500 y 650 µg/mL, finalmente se agregaron 800 µL de la solución de trabajo de DPPH. Se dejó en reposo durante 30 min alejado de la luz y se leyó a una longitud de onda de 517 ղm. Todos los extractos se midieron por triplicado.

Se aplicó el mismo procedimiento para la sustancia patrón Trolox (0-10 µg/mL). Con los valores de absorbancia obtenidos se determinó el porcentaje de captación de radicales libres (DPPH*) mediante la siguiente expresión:


La concentración inhibitoria media (IC50) se determinó a partir de la gráfica del porcentaje de inhibición en función de la concentración y corresponde a la concentración en la que se neutraliza el 50 % de los radicales libres del DPPH.


Método ABTS ● + (Ácido 2,2'-azinobis (3- etilbenzotiazolín)-6 Sulfónico)

El radical catiónico ABTS•+ es un cromóforo de color verde azulado que se absorbe a una longitud de onda de 734 ղm, este se forma por una reacción de oxidación del ABTS (2,2'-azino-bis- (3-etil benzotiazolin-6-sulfonato de amonio) con persulfato de potasio. En presencia de una sustancia captadora de radicales libres el compuesto reacciona y se decolora hacia amarillo pálido. La reducción del reactivo se comprueba espectrofotométricamente mediante la disminución de la absorbancia a 734 ղm.18 Se preparó el radical ABTS•+ que se obtiene por la reacción de ABTS (7 mM) con persulfato potásico (2,45 mM) incubado a temperatura ambiente (25 °C) y en la oscuridad durante 16 h. Una vez formado el radical ABTS•+ se diluyó con agua bidestilada hasta obtener un valor de absorbancia (A) de 0,7 ± 0,02 a una longitud de onda de 734 ղm. Cada extracto se diluyó con 2 mL de su solvente (metanol:etanol 4:1). A 20 µL de la solución muestra (0, 0,55, 2, 5,5 y 7 mg/mL) se le añadieron 980 µL de la solución de ABTS•+ y se midió la absorbancia del blanco y de los extractos a los 7 min.

Todos los extractos se midieron por triplicado. Se aplicó el mismo procedimiento para la sustancia patrón Trolox (0 - 10 µg/mL). Con los valores de absorbancia obtenidos se determinó el porcentaje de captación de los radicales libres (ABTS•+) mediante la siguiente expresión:

La IC50 se determinó a partir de la gráfica del porcentaje de inhibición en función de la concentración, y corresponde a la concentración en la que se neutraliza el 50 % de los radicales libres del ABTS•+.

 

RESULTADOS

En el análisis fitoquímico preliminar, las reacciones de coloración y precipitación del extracto etanólico de Prosopis pallida permitieron caracterizar cualitativamente los grupos de compuestos fenólicos y taninos, seguido de los flavonoides, como los compuestos más abundantes (tabla 1).


El contenido de los fenoles totales en el extracto etanólico de las hojas de Prosopis pallida mediante el método de Folin-Ciocalteu fue de 8,39 mg/Eq de ácido gálico/g de extracto seco.

En la evaluación de la actividad antibacteriana del extracto etanólico de las hojas de Prosopis pallida mediante el método de difusión en agar sólo se observó efecto frente a Staphylococcus aureus con un halo de inhibición de 18,1 ± 1,2 mm con la concentración 100 mg/mL, mientras que con las demás cepas microbianas estudiadas y con el DMSO (control negativo) no se observó actividad inhibitoria; sin embargo, con el ciprofloxacino (control positivo) se apreció actividad inhibitoria frente a todas las cepas ensayadas que varió de 28,0 ± 0,8 a 45,2 ± 1,3 mm (tabla 2). La concentración inhibitoria mínima del extracto frente a Staphylococcus aureus fue 1 000 µg/mL (tabla 3).

 


Los resultados de la actividad antioxidante del extracto etanólico de las hojas de Prosopis pallida mediante el método de DPPH mostró una IC50 de 456,8 ± 1,5 µg/mL y por el método de ABTS•+ fue de 470,2 ± 2,6 µg/mL (tabla 4).

 

DISCUSIÓN

En el estudio fitoquímico, el extracto de las hojas mostró: fenoles, taninos y flavonoides. Diversos estudios señalan la presencia de otros compuestos como polifenoles, flavonoides y taninos en la misma especie, estos últimos en un porcentaje de 0,8 % a 2,0 %.5 La actividad antibacteriana del extracto etanólico de las hojas de Prosopis pallida mediante el método de difusión en agar se evidenció con un halo de inhibición de 18,1 ± 1,2 mm frente a la cepa de Staphylococcus aureus ATCC 25923 en concentración de 100 mg/mL; dicho resultado es aproximado al reportado por Bussman y otros en 2010, quienes reportaron un valor de 15 mm de halo de inhibición para el extracto etanólico de las hojas de Prosopis pallida.4 Este resultado también puede compararse con el que se observó con el extracto etanólico de las hojas de Prosopis juliflora eficaz contra Staphylococcus aureus ATCC 25923 el cual evidencia un halo de inhibición de 12,72 + 0,67 mm en una concentración de 100 mg/mL mediante el método de difusión en disco.19 La diferencia entre estos resultados puede deberse a ciertos factores, por ejemplo, a la posible diversidad entre las especies de las plantas, a la ubicación geográfica, a los disolventes utilizados y a la presencia de los compuestos activos en cada una de las especies.

El extracto etanólico de las hojas de Prosopis pallida presentó una CMI de 1 000 µg/mL frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923 y este fue el primer reporte sobre esta actividad. La actividad antibacteriana del extracto etanólico de las hojas de Prosopis pallida puede atribuirse a la presencia de polifenoles, flavonoides y taninos que se comprobaron en el análisis fitoquímico preliminar.

Los mecanismos responsables de la toxicidad fenólica pueden atribuirse a los microorganismos e incluyen la inhibición de la enzima beta-glucano sintasa por los compuestos oxidados, posiblemente mediante la reacción con grupos sulfhidrilo o las interacciones no específicas con las proteínas.20 Además se observó una susceptibilidad del extracto a las bacterias grampositivas, la ausencia de sensibilidad a las bacterias gramnegativas, lo que podría deberse, según estudios, a la membrana exterior y a las moléculas de lipopolisacárido que constituyen una barrera contra la fácil penetración de algunas moléculas antimicrobianas, y las bacterias grampositivas no tienen este tipo de membrana externa.21

Muchas preparaciones fitoquímicas con alto contenido de flavonoides han reportado actividad antibacteriana. En ellas se han aislado e identificado las estructuras de los flavonoides que tienen esta actividad; apigenina, galangina, pinocembrina, naringina, naringenina, galato de epigalocatequina y sus derivados, 7-O-glucósido de luteolina, quercetina, 3-O-metilquercetina y varios glicósidos de quercetina.22

La función antibacteriana de los taninos tiene lugar fundamentalmente cuando se priva a los microorganismos del medio apropiado para que puedan desarrollarse. Esta propiedad está ligada a su capacidad para unirse a las proteínas de la piel, es decir, para combinarse con macromoléculas, en particular con hidratos de carbono y proteínas que hace que las capas superficiales sean menos permeables y protejan a las capas subyacentes, resultado de los enlaces entre los taninos y las fibras de colágeno de la piel que le confieren resistencia al agua, al calor y a la abrasión. Estos enlaces se establecen por medio de interacciones hidrófobas y puentes de hidrógeno entre los grupos fenólicos de los taninos y las proteínas en los que intervienen también enlaces covalentes para asegurar en el tiempo la estabilidad de la combinación entre ellos y las estructuras de colágeno.23

La actividad antioxidante del extracto etanólico de las hojas de Prosopis pallida mediante DPPH reportó un IC50 de 456,8 ± 1,5 µg/mL y para la prueba con ABTS•+ presentó un IC50 de 470,2 ± 2,6 µg/mL. Este resultado se comparó con la cantidad de fenoles totales que representa 8,39 mgEAG/g de extracto seco. Esta actividad podría deberse a la gran concentración de compuestos fenólicos que contiene como: fenoles, taninos y flavonoides.

Diversos estudios han demostrado que la actividad antioxidante de los flavonoides se debe a una combinación de sus propiedades como quelante de hierro y captadora de radicales libres, además de su cualidad para inhibir las oxidasas: lipooxigenasa, ciclooxigenasa, mieloperoxidasa y la xantina oxidasa; lo cual evita la formación de especies reactivas de oxígeno y de hidroxiperóxidos orgánicos.24, 25

Los taninos son capaces de captar radicales libres e inhibir la peroxidación lipídica, además inhiben la autoxidación del ácido ascórbico (Vitamina C).26 No existen estudios acerca de la actividad antioxidante de las hojas del algarrobo, solo se encontró una investigación que reportó la actividad antioxidante de la algarrobina e identificó como principales compuestos fenólicos a los flavonoides C-glucósidos y glucósidos de quercetina.27

Este estudio demostró que el extracto etanólico de las hojas de Prosopis pallida posee actividades antimicrobiana y antioxidante. La presencia de compuestos fenólicos, flavonoides y taninos actuarían como responsables de dichas actividades. Queda abierta la posibilidad de realizar estudios que determinen su composición química para garantizar su uso terapéutico y llevar a cabo las pruebas de toxicidad para establecer su seguridad.

 

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Recibido: 23 de junio de 2017.
Aprobado: 8 de febrero de 2018.

 

 

Juan Rojas Armas. Instituto de Investigaciones Clínicas, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Perú.
Correo electrónico: jprojasarmas@yahoo.com





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