Aclimatización de vitroplantas de Agave fourcroydes (Lem.) (henequén)

ARTÍCULO ORIGINAL

 

Aclimatización de vitroplantas de Agave fourcroydes Lem. (henequén)

 

Acclimatization of cultured plantlets of Agave fourcroydes Lem. (henequen)

 

 

Yunel Pérez Hernández*
Maryla Sosa del Castillo
Yasmary Rubio Fontanills
Leticia Fuentes Alfonso
Jovana Pérez Ramos
Yusleidys Cortés Hernández

Universidad de Matanzas. Cuba.

 

 


RESUMEN

Introducción: Agave fourcroydes Lem. (henequén) se emplea tradicionalmente en la industria textil y puede ser utilizado en la medicina debido a que contiene diversos metabolitos como inulina y esteroides.
Objetivos: Evaluar el efecto de diferentes sustratos y las condiciones de riego e iluminación en el proceso de aclimatización de las plántulas de henequén obtenidas por cultivo in vitro.
Métodos: Se utilizaron tres variedades de sustratos a partir de las combinaciones de pulpa de henequén y gravilla en diferentes proporciones. Antes de la aclimatización se realizó la desinfección de las plántulas con CuSO4 (200 µmol/L-1) durante 60 min. Se controlaron los factores de iluminación y humedad durante 30 d de aclimatización. Se evaluaron los indicadores siguientes: porcentaje de supervivencia, área foliar, grosor del tallo, contenido de clorofila, azúcares reductores, carbohidratos y proteínas solubles totales. Se realizó un diseño experimental completamente aleatorio con tres repeticiones.
Resultados: Se obtuvieron porcentajes de supervivencia superiores al 80 % con los distintos tratamientos y no se evidenciaron diferencias con relación al área foliar y al grosor del tallo transcurridos 30 días de aclimatización. Se observó un aumento de los contenidos de azúcares, clorofilas y proteínas en las plantas aclimatizadas con respecto a las vitroplantas antes del experimento. Los sustratos con mayor densidad mostraron los mejores resultados en los indicadores bioquímicos evaluados.
Conclusiones: La mezcla de pulpa de henequén y gravilla junto con la iluminación y el riego posibilitó la aclimatización de las plántulas. Los tratamientos con mayores densidades de sustrato mejoraron sus respuestas metabólicas.

Palabras clave: Agave fourcroydes; aclimatización; azúcares reductores; clorofila; cultivo in vitro.


ABSTRACT

Introduction: Traditionally used in the textile industry, Agave fourcroydes Lem. (henequen) could also be useful for medical purposes, due to its content of a variety of metabolites, such as inulin and steroids.
Objectives: Evaluate the effect of different substrates and watering and lighting conditions on the process of acclimatization of henequen plantlets cultured in vitro.
Methods: Three substrate types were used based on different proportions of henequen pulp and gravel. Acclimatization was preceded by disinfection of the plantlets with CuSO4 (200 µmol/l-1) for 60 min. Light and humidity conditions were controlled during 30 days of acclimatization. The following indicators were evaluated: survival percentage, leaf area, stem thickness and content of chlorophyll, reducing sugars, carbohydrates and total soluble proteins. The study was based on a fully randomized experimental design with three replicates.
Results: Survival percentages above 80 % were obtained with the used treatments. Differences were not found in leaf area and stem thickness after 30 days of acclimatization. An increase was observed in the content of sugars, chlorophyll and proteins in the plants acclimatized with respect to the plantlets cultured in vitro before the experiment. Substrates with higher density showed the best results in the biochemical indicators evaluated.
Conclusions: Mixture of henequen pulp and gravel combined with the lighting and watering treatment enabled acclimatization of the plantlets. Treatments with higher substrate density improve metabolic responses.

Key words: Agave fourcroydes; acclimatization; reducing sugars; chlorophyll; in vitro culture.


 

 

INTRODUCCIÓN

Agave fourcroydes Lem. (Agavaceae) es una especie importante cultivada durante muchos años en la región central de América y del Caribe. Esta planta se usa principalmente para obtener fibras de las hojas y del tallo. También son importantes los numerosos metabolitos que contiene la pulpa de las hojas como saponinas, inulina, fructanos y flavonoides, los cuales tienen diferentes aplicaciones tanto en la industria farmacéutica como alimentaria.1 Las saponinas y los flavonoides tienen actividad hemolítica, expectorante, antiinflamatoria y estimuladora del sistema inmune. Varios autores mencionaron los efectos antibacteriano, antifúngico, antiprotozoario, molusquicida y citotóxico de estos compuestos.2-5 Esta última propiedad convierte a estos metabolitos en posibles fármacos para el tratamiento de tumores lo cual tiene gran importancia, ya que muchos pacientes hacen resistencia a los químicos convencionales que se emplean en las quimioterapias.6

En Cuba, como consecuencia de la crisis económica de los 90, disminuyó el cultivo del henequén, así como sus productos, debido a que muchas áreas destinadas a la siembra de esta planta fueron destruidas, quemadas, abandonadas o invadidas por la vegetación indeseable. Asimismo la improductividad de los suelos, el tratamiento inadecuado de las cosechas y los problemas industriales contribuyeron a la deforestación de dichas plantaciones lo cual redujo la obtención de la pulpa y de sus valiosos componentes a gran escala.7

En el Centro de Estudios Biotecnológicos de la Universidad de Matanzas, Cuba, se desarrolló una metodología para favorecer la micropropagación del henequén8 con el objetivo de obtener plantaciones homogéneas y de alta calidad en un período de tiempo relativamente corto. Sin embargo, debido a las condiciones particulares del ambiente in vitro, las vitroplantas desarrollan un grupo de características morfológicas, fisiológicas y bioquímicas que inciden negativamente en la supervivencia de las plántulas en condiciones ex vitro.9,10 Por este motivo, la fase de aclimatización es una etapa crítica, durante la cual el tratamiento de los diferentes factores ambientales influyen decisivamente en el rendimiento total del proceso. El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto de diferentes sustratos y las condiciones de riego e iluminación en el proceso de aclimatización de las plántulas de henequén obtenidas por cultivo in vitro.

 

MÉTODOS

La investigación se desarrolló en el Centro de Estudios Biotecnológicos (CEBIO) de la Universidad de Matanzas, Cuba.

Material vegetal

Para el estudio de la aclimatización se utilizaron vitroplantas de A. fourcroydes procedentes del protocolo de micropropagación establecido por González.(8) Las plantas permanecieron en un medio MS (Murashige y Skoog) para el enraizamiento.11 La especie fue identificada por especialistas del Jardín Botánico de Matanzas y se tomaron como referencia plantas in situ y de ejemplares existentes en el herbario virtual de la Universidad de Arizona (No.266791 y No. 266792) (Howard Scott Gentry).

Aclimatización de las vitroplantas

El proceso de aclimatización se desarrolló en casas de cultivo donde se controla la intensidad luminosa [flujo de fotones fotosintéticos (FFF)] en diferentes condiciones que se crean con el empleo de capas de malla zaran de color negro. Diariamente durante las dos primeras semanas se asperjó sobre las plántulas un volumen de agua de 1,2 L/m2 mediante un aspersor manual por espacio de dos minutos cada una hora entre las 10 de la mañana y las 3 de la tarde. Se aplicó este sistema de riego con el objetivo de aumentar la humedad relativa y disminuir la pérdida de agua de las vitroplantas debido a la transpiración excesiva.

Las vitroplantas se mantuvieron en bandejas de poliestireno de 70 alveolos durante 30 d en condiciones de aclimatización a temperatura entre 24 y 30 °C de acuerdo con las condiciones ambientales en el mes de abril de 2015.

Preparación del sustrato y tratamientos empleados

El sustrato consistió en una mezcla de pulpa de henequén (PH) descompuesta, descontaminada previamente, y gravilla (G) con un tamaño promedio de partículas de 2 mm. Las vitroplantas extraídas del medio in vitro se lavaron con agua corriente para eliminar el agar y a continuación se sumergió el sistema radicular en una solución de sulfato de cobre (200 µmol/L) durante 1 h.

Se prepararon tres sustratos diferentes con la pulpa de henequén (PH) y la gravilla (G) para e valuar los tratamientos.

- PH y densidad promedio de 0,65 g/cm-3.

- 3PH:1G (v:v) y densidad promedio de 1,73 g/cm-3.

- 1PH:1G (v:v) y densidad promedio de 2,17 g/cm-3.

Se emplearon para cada tratamiento 30 plantas con tres réplicas.

Indicadores evaluados

Se escogieron aleatoriamente 10 plantas por cada tratamiento para evaluar y determinar los indicadores morfológicos, bioquímicos y morfofisiológicos de las vitroplantas antes y después del proceso de aclimatización.

Indicadores morfofisiológicos

Porcentaje de supervivencia

Área foliar (AF): se midieron el largo (L) y el ancho (A) de las hojas con un pie de rey. Se realizó el cálculo mediante la siguiente ecuación: AF=L*A*0,68.(9)

Grosor del tallo: para medirlo se empleó un pie de rey.

Contenido de clorofilas a, b y totales

Las hojas se maceraron en un mortero de porcelana con 5 mL de etanol (96 %) como solvente para extraer los pigmentos. Las ecuaciones propuestas para calcular la concentración de clorofilas fueron las siguientes:12

Ca (mg L-1) = 13.95 (A665) -6.68 (A 644)

Cb (mg L-1) =24.96 (A644) -7.32 (A 665)

Ca= concentración de clorofila a

Cb= concentración de clorofila b

Clorofila total: Ca+b (mg/L)= (20.2 A649) +(8.02 A665 ).

Determinación del contenido de carbohidratos solubles totales

En una muestra de 0,5 g de las plantas de los distintos tratamientos se determinó el contenido de carbohidratos solubles totales. Se aplicó el método del fenol-ácido sulfúrico13 con la D-glucosa (Sigma) como azúcar patrón. La absorbancia se comprobó con una longitud de onda de 490 nm.

Determinación del contenido de azúcares reductores

El contenido de azúcares reductores se determinó mediante el método del ácido dinitrosalisílico con D-glucosa (Sigma) como azúcar patrón.14 La absorbancia se comprobó con una longitud de onda de 456 nm.

Determinación del contenido de proteínas solubles totales

El contenido de proteínas solubles totales se determinó mediante el método de Lowry con albúmina de suero bovino (ASB) como patrón.15 La absorbancia se comprobó con una longitud de onda de 750 nm.

Diseño experimental y procesamiento estadístico

Se hizo un diseño totalmente aleatorio con 30 plántulas para cada tratamiento. Se ajustó a una distribución normal mediante la prueba de bondad de ajuste de Kolmogorov-Smirnov y se determinó la homogeneidad de varianza mediante las pruebas de Bartlett.16 Los datos que cumplieron los requisitos exigidos se procesaron mediante ANOVA de clasificación simple y se utilizó la prueba de rangos múltiples de Duncan para la comparación entre las medias. Los datos que no cumplieron con estas exigencias se procesaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis y las medias se compararon mediante la prueba de rangos múltiples de Student-Newman-Kwels (SNK) (p≤ 0,05). El análisis estadístico de la supervivencia se realizó mediante el análisis de proporciones con el programa Compapró versión 3.01 sobre Windows.

 

RESULTADOS

Evaluación del proceso de aclimatización

Las vitroplantas aclimatizadas mostraron porcentajes de supervivencia superiores al 80 % (tabla 1) y homogeneidad en los diferentes tratamientos. Estos resultados guardan relación con el tratamiento en las condiciones ambientales existentes durante la etapa de aclimatización.

Los indicadores área foliar y grosor del tallo (tabla 2) no mostraron diferencias significativas entre los distintos tratamientos evaluados durante 30 d de aclimatización.

 

La desinfección de las vitroplantas con sulfato de cobre (200 µmol/L) durante 60 min demostró ser eficiente, ya que no se observó la presencia de hongos patógenos en las raíces.

Evaluación de los indicadores bioquímicos en plántulas con 30 días de aclimatización

El contenido de clorofilas a, b y totales fue marcadamente diferente entre los tratamientos (Fig.). Las concentraciones más altas de clorofilas totales se obtuvieron con el sustrato 1PH:1G; mientras que entre los sustratos PH y 3PH:1G no se apreciaron diferencias notables. Al comparar estos valores con la concentración de clorofilas en las vitroplantas antes de su traslado a las condiciones ex vitro, se observó un aumento del contenido de estos pigmentos después de 30 d de aclimatización.

 

La tabla 3 muestra los valores correspondientes a la cantidad de carbohidratos solubles totales y azúcares reductores en las hojas de las plántulas aclimatadas. Los mayores contenidos de ambas sustancias se obtuvieron en los tratamientos con las combinaciones de pulpa de henequén y gravilla, entre los cuales no hubo diferencias importantes, pero fueron superiores a los del sustrato con pulpa de henequén solamente. Por otra parte, transcurridos 30 d de aclimatización se observó un aumento considerable de los carbohidratos totales y los azúcares reductores en los tratamientos en comparación con las vitroplantas al inicio del proceso.

Los contenidos de proteínas solubles totales (tabla 4) también fueron superiores en los sustratos con las mayores densidades en relación con el tratamiento con 100 % de pulpa de henequén. Se observó un aumento de la concentración de las proteínas solubles en las plantas aclimatizadas en comparación con los valores encontrados en las hojas de las vitroplantas.

 

DISCUSIÓN

Tratamiento de los factores ambientales en el proceso de aclimatización

Los porcentajes elevados de supervivencia después del proceso de aclimatización pueden estar relacionados con el tratamiento de los distintos factores ambientales, en especial del agua, la iluminación y el sustrato. El riego sistemático realizado en las dos primeras semanas fue esencial para reducir la diferencia del potencial hídrico entre las plántulas y el medio y evitar la deshidratación por excesiva transpiración. Debido a los cambios morfológicos y fisiológicos que experimentan las vitroplantas en las condiciones in vitro, en la primera etapa de la aclimatización las plántulas no pueden controlar el cierre estomático de manera eficiente, por tanto se observan tasas elevadas de transpiración.17 El control de la radiación solar en este período también desempeñó una función importante, ya que el flujo elevado de fotones sobre las hojas de las plántulas puede provocar fotoinhibición y disminución de la actividad fotosintética. Este fenómeno se ha relacionado con un pobre desarrollo de la ultraestructura de los cloroplastos, así como con la destrucción de los pigmentos fotosintéticos y los complejos proteína-clorofila en los fotosistemas.18,19

El incremento progresivo de la luz después de dos semanas y el alargamiento de los intervalos de riego también debió contribuir al proceso de aclimatización de las plántulas y a su comportamiento autotrófico. Esto se debe a la adaptación progresiva de las plántulas en ambientes con menor potencial hídrico. Estas condiciones permiten el desarrollo de las cubiertas epicuticulares a partir de la producción de ceras, lo cual contribuye a un mayor control del proceso de transpiración durante la aclimatización.20,21

El uso de la pulpa de henequén descompuesta y las mezclas de pulpa con gravilla fueron sustratos efectivos para el proceso de aclimatización. Esto puede estar asociado a que dichos sustratos suministran el oxígeno necesario a los centros meristemáticos para desarrollar raíces y, a su vez, permiten el drenaje eficiente que evita la pudrición en condiciones de humedad elevada.22 En trabajos similares se utilizó materia orgánica mezclada con diferentes sustratos como vermiculita, arena y fragmentos de madera en distintas proporciones para la aclimatización de especies como Vitis vinifera L.,23 Vigna subterranea L.,24 Phoenix dactylifera L.25 y Orchis catasetum.26

El uso del sulfato de cobre como agente antimicrobiano27 fue un factor que debió contribuir a elevar los índices de supervivencia. Se recomienda el uso de fungicidas para los trabajos de aclimatización, porque al trasladar las plántulas de las condiciones in vitro a las ex vitro quedan expuestas al ataque de hongo patógenos, ya que en las primeras etapas de este proceso es necesaria una humedad relativa elevada.

Los resultados con relación al área foliar y al grosor del tallo pueden estar en concordancia con el crecimiento lento que presenta esta especie y otros agaves como consecuencia del mecanismo especial de fijación del carbono (metabolismo ácido de las Crasuláceas).28

Contenido de clorofilas

Los elevados contenidos de clorofilas en las plantas aclimatizadas con respecto a las vitroplantas al inicio del proceso, pueden estar relacionados con el tratamiento de las condiciones ambientales durante la aclimatización, lo cual permitió el desarrollo del tejido parénquima clorofílico y el incremento de la síntesis de clorofilas. En los estudios realizados por Jahan y Anis19 con Cardiospermum halicacabum L. se observó disminución de la concentración de estos pigmentos en los primeros días de aclimatización; sin embargo, después de transcurridos 28 días aumentaron notablemente las concentraciones de las clorofilas a, b y de los pigmentos carotenoides.

La reducción de la diferencia del potencial hídrico entre las plántulas y el medio tuvo efecto positivo en el desarrollo del parénquima clorofílico de las hojas y en la recuperación de las plántulas mediante la aplicación del riego sistemático. Los tejidos bien hidratados tienen una mejor actividad metabólica y, como resultado, se reducen los daños provocados por las especies reactivas del oxígeno (ERO) sobre las estructuras fotosintéticas. Las ERO se producen de manera natural durante la respiración aerobia o durante el funcionamiento de la cadena de transporte electrónico en el cloroplasto. La presencia de un electrón desparejado en la estructura de estas sustancias convierte estos compuestos en altamente reactivos. Se demostró en numerosos trabajos que los radicales libres aumentan en condiciones de estrés hídrico y provocan la oxidación de las proteínas, del ADN y de los lípidos de la membrana, lo cual afecta alas funciones biológicas de los componentes o a las macromoléculas y a las distintas funciones celulares.29,30

Contenido de carbohidratos, azúcares reductores y proteínas

Los resultados del contenido de carbohidratos, azúcares reductores y proteínas solubles evidenciaron que el uso de los sustratos con mayor densidad junto con las condiciones ambientales favorece la actividad metabólica de las plántulas durante el proceso de aclimatización. Esto puede estar relacionado con la firmeza que le proporciona la gravilla al sustrato, lo cual permite un mejor sostén de las plántulas en su desarrollo. Asimismo, el aumento de la porosidad puede facilitar la penetración del oxígeno e incrementar la respiración radicular, y esto contribuye a una mayor producción de energía metabólica para los procesos anabólicos.

El aumento de los contenidos de carbohidratos, azúcares reductores y proteínas solubles totales en las plántulas aclimatadas, con relación a las vitroplantas, demuestra que hubo aumento de la actividad fotosintética y del metabolismo de las proteínas durante el proceso de aclimatización. Este aumento también pudo estar relacionado con el desarrollo del control estomático de las plántulas y con una mejor regulación del estado hídrico de los tejidos, lo cual es indispensable para que ocurran los procesos metabólicos de manera eficiente.10 Por otra parte, el aumento de los sustratos respiratorios permite generar mayores cantidades de esqueletos carbonados durante los procesos de la glucólisis y del ciclo de Krebs, los cuales pueden ser utilizados para la síntesis de novo de aminoácidos, proteínas y diversos componentes celulares.18

En general, la mezcla de pulpa de henequén con gravilla junto con la iluminación y el riego fueron efectivos para alcanzar una elevada supervivencia de plántulas de henequén provenientes de la fase in vitro. El aumento de los contenidos de clorofilas, carbohidratos, azúcares reductores y proteínas en las plántulas de 30 días de aclimatización evidenció el aumento de la respuesta metabólica y el tránsito hacia el estado autotrófico.


Conflicto de intereses

Los autores plantean que no tienen conflicto de intereses.

 

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Recibido: 14/1/2016
Aprobado: 14/5/2018

 

 

Yunel Pérez Hernández. Universidad de Matanzas. Correo electrónico: yunel.perez@umcc.cu





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