Evaluación de tres extractos de plantas para inhibir el desarrollo de larvas de los parásitos gastrointestinales de los ovinos

ARTÍCULO ORIGINAL

 

Evaluación de tres extractos de plantas para inhibir el desarrollo de larvas de los parásitos gastrointestinales de los ovinos

 

Evaluation of three plant extracts as inhibitors of larval development in gastrointestinal parasites of sheep

 

 

Carlos Eduardo Rodríguez-Molano*
Néstor Julián Pulido-Suarez
Alejandra Rodríguez Montaña

Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia (Tunja-Boyacá, Colombia).

 

 


RESUMEN

Introducción: Las parasitosis gastrointestinales constituyen uno de los problemas sanitarios más importantes para la producción ovina en todo el mundo.
Objetivo: Evaluar la actividad de los extractos acuosos de Melia azadarach L., Chenopodium ambrosioides y de las semillas de Carica papaya L. como inhibidores del desarrollo in vitro de larvas de los parásitos gastrointestinales de los ovinos.
Métodos: Se utilizaron las hojas secas y las semillas para elaborar cada extracto mediante el método de obtención Soxhlet. Se tomaron muestras de materia fecal y se obtuvieron larvas en estadio L3 de los parásitos gastrointestinales de los ovinos. Las larvas en estadio L3 se expusieron a los extractos etanólicos los cuales se usaron para evaluar la eficacia de la inhibición larval por triplicado en cultivos de heces en las concentraciones siguientes: 100 mg/mL, 50 mg/mL, 25 mg/mL y 5 mg/mL. Se utilizó como control positivo Levamizol al 15 % y como controles negativos, agua destilada y etanol. Se calculó el porcentaje promedio de la inhibición larval por triplicado y se realizó un análisis estadístico transformando dichos datos mediante la fórmula arcoseno raíz (x) con el fin de que los valores siguieran una distribución normal, se comprobó con la prueba de Shapiro-Wilk y un análisis de varianza ANOVA con el programa SPSS.
Resultados: Las plantas que mostraron la mayor inhibición de migración larval contra los parásitos gastrointestinales de los ovinos fueron M. azadarach y C. ambrosioides.
Conclusión: El extracto etanólico de C. ambrosioides mostró la mayor inhibición (p< 0,05) de migración larval in vitro contra los parásitos gastrointestinales de los ovinos.

Palabras clave: pequeños rumiantes; extracto vegetal; Melia azadarach L.; Chenopodium ambrosioides; semillas de Carica papaya L.


ABSTRACT

Introduction: Gastrointestinal parasitosis is one of the most important health problems in sheep farming worldwide.
Objective: Evaluate the activity of aqueous extracts of Melia azadarach L.,Chenopodium ambrosioides and Carica papaya L seeds as in vitro inhibitors of larval development in gastrointestinal parasites of sheep.
Methods: Dry leaves and seeds were used to prepare the extracts using the Soxhlet extraction method. Fecal matter samples were collected and L3-stage larvae of gastrointestinal parasites of sheep were obtained. The L3-stage larvae were exposed to the ethanolic extracts to evaluate larval inhibition effectiveness in triplicate in stool cultures at the following concentrations: 100 mg/ml, 50 mg/ml, 25 mg/ml and 5 mg/ml. The positive control was 15% levamisol, and the negative controls were distilled water and ethanol. Estimation was made of the average larval inhibition percentage in triplicate and a statistical analysis was performed transforming those data with the arcsin (x) formula so that the values would follow a normal distribution. Verification was conducted with the Shapiro-Wilk test and an analysis of variance (ANOVA) was made with the SPSS software.
Results: The plants exhibiting the greatest larval migration inhibition against gastrointestinal parasites of sheep were M. azadarach and C. ambrosioides.
Conclusion: The ethanolic extract of C. ambrosioides showed the greatest larval migration inhibition (p< 0.05) in vitro against gastrointestinal parasites of sheep.

Key words: small ruminants, plant extract, Melia. azadarach L., Chenopodium ambrosioides L. Carica. papaya L. seeds.


 

 

INTRODUCCION

En Colombia, los nematodos gastrointestinales son los parásitos más frecuentes de los rumiantes, especialmente de los que habitan en las zonas templadas y húmedas, ya que las condiciones ecológicas propician un ciclo de propagación eficiente, favorecido por la práctica del pastoreo en el sistema de producción. Estas parasitosis se presentan generalmente como infecciones mixtas en la que participan varias especies que se alojan en el abomaso y en el intestino y causan gastroenteritis parasitarias, enfermedades crónicas de baja mortalidad, pero con un alto impacto negativo sobre la productividad.1

El control de nematodos de los géneros Haemonchus, Ostertagia, Trichostrongylus, Cooperia, Bunostomum, Oesophagostomum, entre otros, se basa en el uso de antihelmínticos químicos a los cuales los nematodos han desarrollado cierta resistencia y se consideran sustancias residuales en la carne de ovino que pueden causar efectos nocivos en el consumidor final.2

Por esta razón, se seleccionaron plantas con acción antihelmíntica según la tradición popular en el departamento de Boyacá, Colombia. Además, se tuvo en cuenta que estas plantas tuvieran alcaloides, taninos, cumarinas, saponinas y flavonoides en su composición química.

La transmisión de los nematodos intestinales ocurre de forma directa y las principales formas de entrada del parásito al hospedero son la ingestión, a través de la piel y de la leche. Los forrajes o las aguas contaminados con larvas en estadio 3 de estos parásitos son las principales fuentes de trasmisión.

Después de alcanzar el estadio adulto en el aparato digestivo del rumiante, las hembras y los machos de los tricostrongilidos copulan y tiene lugar la oviposición. Los huevos se liberan en el ambiente a través de las heces y se dispersan por las praderas. La eclosión y el desarrollo de las larvas hasta el estadio 3 dependerán de la temperatura, del pH, de la humedad y de la manipulación, lo cual puede influir en la probable infección de los demás animales.4

Según las cifras del inventario ovino-caprino mundial del Instituto Colombiano Agropecuario (ICA)5, Colombia ocupa el lugar 63 entre los productores de ovejas y cabras precedido por países como China y como Australia, Nueva Zelanda, India e Irán, respectivamente, considerados los mayores productores mundiales.6

La actividad productiva en Colombia está distribuida en todos los departamentos; sin embargo, es más intensiva en los departamentos de Guajira, Magdalena, Atlántico, Bolívar, Sucre y Córdoba; en Santander, Nariño, Putumayo, Cesar y el altiplano Cundiboyacense existe una producción ovina y caprina importante.7 Colombia viene fomentando el desarrollo de la producción ovino-caprina con el apoyo de diferentes organizaciones gremiales que tienen como finalidad mejorar la productividad para lograr que este sector ganadero prospere.8

El objetivo de este estudio es evaluar la actividad de los extractos acuosos de M. azadarach L., C. ambrosioides L. y de las semillas de C. papaya L. como inhibidores del desarrollo in vitro de las larvas de los parásitos gastrointestinales de los ovinos.

 

METODOS

Tipo de estudio

En este estudio experimental se trabajó con poblaciones de larvas en estadio 3 de parásitos gastrointestinales de los ovinos, las cuales fueron expuestas in vitro a extractos etanólicos para evaluar la inhibición del desarrollo después de la exposición.

Este proyecto se desarrolló en tres etapas. En la primera se recolectó el material vegetal en la granja La María de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia (UPTC) y se elaboraron los extractos en el Laboratorio de Nutrición Animal de la UPTC. En la segunda etapa se tomaron las muestras de materia fecal de los ovinos criollos en el municipio de Nuevo Colón (Boyacá), se transportaron al laboratorio y allí se conservaron en las condiciones adecuadas. En la tercera etapa se evaluó el efecto antihelmíntico de los extractos, se calculó el porcentaje de inhibición de las larvas con los extractos etanólicos y en los grupos controles, y se determinaron los metabolitos secundarios presentes en los extractos.

Recolección del material vegetal y su identificación en el herbario

Se seleccionaron para la investigación M. azadarach L., C. ambrosioides y semillas de C. papaya L. El material se recogió en el campus de la UPTC ubicada en la ciudad de Tunja en el valle del Alto Chicamocha, región del altiplano cundiboyacense sobre la cordillera oriental de los Andes en el centro del país a una altura promedio de 2 820 msnm y temperatura promedio de 12 °C.

Se tomaron las muestras una vez localizadas las especies vegetales, se tomaron tres ejemplares de cada planta, se conservaron en etanol al 70 % y se secaron durante tres días a 70 °C. Posteriormente se etiquetaron y se montaron, se determinaron y se incluyeron en la colección de referencia del herbario de la UPTC en Tunja, Colombia, según la denominación de Néstor Julián Pulido Suarez (NJPS): [Chenopodium ambrosioides L. NJPS 22623], [Melia azadarach L. NJPS 22415] y [Carica papaya L. NJPS 22514].

Obtención de los extractos

Se tomaron las hojas jóvenes de M. azadarach L. y C. ambrosioides L. justo antes del inicio de la floración, sin cambios manifiestos a simple vista como manchas ni presencia de áfidos. Se extrajeron las semillas del fruto de C. papaya L. Las hojas y las semillas se secaron en un horno de aire circulante a 60 °C durante 24 a 48 h, se almacenaron en sobres de papel a temperatura ambiente (17 a 20 °C) y se protegieron de la luz hasta el momento de la extracción.

La extracción se realizó en el Laboratorio de Bioquímica y Nutrición Animal de la UPTC mediante el método Soxhlet con etanol:agua destilada en una proporción 60:40. Las hojas y las semillas secas de las plantas se trituraron manualmente para obtener los extractos etanólicos. Se agitaron con varilla de vidrio todos los días durante una semana. Se realizaron dos extracciones de cada especie. Después de la primera extracción, se filtraron los extractos de cada especie de planta y el nuevo líquido de extracción se añadió al material vegetal, lo que dio lugar a una segunda extracción. Los filtrados de cada especie vegetal se desecaron en un rotaevaporador marca Heidipold a 40 °C y 100 rpm para eliminar el etanol. Después de la extracción, la fase acuosa se mantuvo en refrigeración a 4 °C9.De la solución madre obtenida se prepararon cuatro concentraciones: 100, 50, 25 y 5 mg/mL.

Identificación cualitativa de los metabolitos secundarios

Con el fin de corroborar la presencia de metabolitos secundarios, a cada uno de los extractos puros se les realizaron pruebas cualitativas:

· Reacción de espuma (saponinas): La presencia de saponinas se determinó tomando 2 mL de cada extracto, a los cuales se le añadió 10 mL de agua, se agitó vigorosamente por 30 segundos y se dejó en reposo durante 15 minutos en la muestra.10 La proporción de saponinas se midió de acuerdo con la altura de la espuma sobrenadante de la siguiente forma:

- Altura menor que 5 mm = no se detectan saponinas

- Altura de 5 a 9 mm = contenido bajo de saponinas

- Altura de 10 a 14 mm = contenido moderado de saponinas

- Altura mayor que 15 mm = contenido alto de saponinas

· Prueba de Wagner (alcaloides): La prueba cualitativa de los alcaloides se realizó utilizando el reactivo de Wagner (yodo y yoduro de potasio). Se tomaron 2 mL de extracto y se le agregaron 2 gotas de reactivo Wagner, se agitó con una varilla de vidrio y se esperó la formación de un precipitado de color marrón.11

· Reacción legal (cumarinas): La presencia de cumarinas se determinó fácilmente mediante la adición de 2 mL de solución de nitroprusiato de sodio al 0,5 % y 2 gotas de hidróxido de potasio. Cuando toma color amarillo que desaparece al agitar el tubo de ensayo, la prueba es positiva.11

· Prueba de Shinoda (flavonoides): La prueba cualitativa de los flavonoides se determinó tomando 2 mL de extracto al que se le adicionaron limaduras de magnesio seguido de ácido clorhídrico concentrado. Se considerapositivo cuando el alcohol amílico se colorea de amarillo, naranja, carmelita o rojo, intensos en todos los casos. Aunque no se conoce el mecanismo de esta prueba, es muy utilizada para reconocer esta clase de compuestos.10

Recolección de las muestras fecales

Se utilizaron las heces de ovejas criollas del municipio de Nuevo Colón, Boyacá- Colombia en edades entre uno y tres años infectadas naturalmente con parásitos gastrointestinales. Las muestras se recolectaron directamente del recto de los animales para determinar el número de huevos por gramo de heces y luego se homogenizaron para obtener una mezcla de la cual se tomaron dos gramos, cantidad necesaria para preparar el cultivo de heces.12

Obtención de larvas en estadio 3. Técnica de Corticelli-Lai

Se utilizó la técnica de Corticelli-Lai para obtener larvas en el estadio 3 (L3). De acuerdo con esta técnica se depositaron aproximadamente 2 g de materia fecal en una placa de Petri de 6 cm de diámetro y esta se colocó dentro de una caja de Petri de 9 cm de diámetro que contenía agua a una altura de 5 mm aproximadamente (cámara húmeda). El cultivo se incubó a temperatura ambiente durante quince días. Transcurrido este tiempo se invirtió la placa de Petri pequeña con la muestra dentro de la placa de Petri grande (migración larvaria L3). Luego de 24 horas, se tomó la fase acuosa con una pipeta Pasteur y se depositó en un tubo de ensayo, se centrifugó a 4 000 rpm durante cuatro minutos y se descartó el sobrenadante.11

Bioensayos sobre larvas en estadio 3 (L3)

Para observar el efecto larvicida de los extractos acuosos, se prepararon las diluciones 100 mg/mL, 50 mg/mL, 25 mg/mL y 5 mg/mL. Los cultivos de nematodos se prepararon por triplicado para cada una de las diluciones. Después de separar las larvas en estadio 3, se tomó una muestra de 20 µL, se depositó en un portaobjetos y se le adicionaron 20 µL de cada uno de los extractos. A partir de ese momento se midió el tiempo y la concentración de los extractos para determinar el tiempo letal 50 (TL50) y la dosis letal 50 (DL50). La evaluación se realizó con un microscopio óptico Nikon Eclipse E 200 con aumento de 40 veces. Se utilizaron como controles L3 de nematodos obtenidas del cultivo con 20 μL de agua destilada.13

Procesamiento matemático de los resultados de la actividad antihelmíntica

La inhibición de la migración larval (IML) se determinó mediante la siguiente fórmula:14

IML = [(A-B) / A] x 100

A = proporción de larvas migradas en el control

B = proporción de larvas migradas en los tratamientos

El porcentaje medio de inhibición larval se calculó a partir de los datos obtenidos durante los conteos por triplicado y se efectuó un análisis estadístico transformando dichos datos mediante la fórmula arcoseno raíz (x) con el fin de que los valores siguieran una distribución normal, se comprobó con la prueba de Shapiro-Wilk y se realizó un análisis de varianza (ANOVA p ≤ 0,05). Las medias se compararon con la prueba de Tukey (p ≤ 0,05). Se utilizó el software estadístico SPSS versión 23.

 

RESULTADOS

Pruebas cualitativas de los metabolitos secundarios

Las pruebas cualitativas de los metabolitos secundarios y el orden secuencial del análisis colorimétrico para identificar las saponinas, los flavonoides, los alcaloides y las cumarinas, arrojó el siguiente resultado (Tabla 1):

 

Actividad antihelmíntica de los extractos

Existe una interacción directamente proporcional entre los extractos acuosos evaluados y las concentraciones, lo que muestra porcentajes satisfactorios de migración larval.

En concentración de 5 mg/mL se observó una diferencia estadísticamente significativa (p≤ 0,05) entre el extracto de M. azadarach L. y el de C. ambrosioides L.

La tabla 2 muestra los porcentajes de migración larval en las diferentes concentraciones evaluadas. El efecto de los extractos también fue estadísticamente significativo y se detectó que solamente la planta C. ambrosioides L. no alcanzo el porcentaje de migración larval mínimo en la concentración de 5 mg/mL. La concentración de 100 mg/mL mostró efecto significativo entre las plantas y se detectó que los extractos de M. azadarach L. y C. ambrosioides L. tienen porcentajes de migración superiores a 74 %.

El control positivo demostró su eficacia con el producto comercial y los controles negativos estuvieron dentro de los rangos establecidos para este estudio (Tabla 2).

 

DISCUSIÓN

Este estudio evaluó el efecto de varias plantas de uso popular para inhibir el desarrollo larvario de los parásitos gastrointestinales de los ovinos según el empleo tradicional que le dan los pobladores del departamento de Boyacá, Colombia.

Las pruebas cualitativas de los metabolitos secundarios permitieron identificar la presencia o la ausencia de metabolitos en las tres especies de plantas. La extracción etanólica permitió reconocer el contenido de alcaloides en algunas de las plantas seleccionadas. De acuerdo con los resultados de la marcha fitoquímica, se comprobó la presencia de alcaloides únicamente en los extractos de M. azadarach y C. ambrosioides. Las cumarinas estaban presentes en todos los extractos utilizados; los flavonoides y las saponinas solo se comprobaron en algunos extractos. Tunón informa que las cumarinas del extracto de Artemisia abrotanum son los repelentes más potentes contra las ninfas de Ixodes ricinus en el extracto de tolueno de ajenjo (Artemisia abrotanum) y en el aceite esencial de las flores de clavel (Dianthus caryophyllum). Este metabolito tiene notable efecto repelente contra las garrapatas (ninfas de Ixodes ricinus) y los mosquitos trasmisores de la fiebre amarilla (Aedes aegypti).14 Por este motivo, los resultados de este estudio varían de acuerdo con el extracto, pero se determina que la presencia de cumarinas en una especie vegetal es decisivo para su efecto antihelmíntico, inhibitorio y repelente.

Este trabajo permitió identificar los extractos de las plantas que, en cada una de las concentraciones evaluadas, mostraron bajos porcentajes de migración de larvas de los parásitos gastrointestinales que infectaron a los ovinos estudiados.

Chenopodium ambrosioides fue una de las plantas que provocó la disminución de la migración de larvas en todas las concentraciones evaluadas, con excepción de la concentración de 5 mg/mL. Estos resultados concuerdan con otros anteriores que demuestran que esta especie se caracteriza por su alto contenido de taninos y por su efecto antihelmíntico en los equinos y en los caprinos.15,16

Chenopodium ambrosioides17,18 y Melia azadarach son dos de las especies que mostraron mayor actividad contra las larvas en estadio 3, mientras que C. papaya no mostró los resultados esperados de acuerdo con la tradición popular.19 Existe muy poca información sobre la actividad antiparasitaria de las especies de las plantas evaluadas en este estudio y, con frecuencia, la que existe no es clara. Es necesario que estos resultados in vitro sean validados con estudios in vivo.

De hecho, algunos estudios muestran una buena relación entre los resultados in vitro e in vivo, por ejemplo, que los taninos condensados purificados de varias especies vegetales reducen la movilidad y la migración de L3 de nematodos y estos resultados concordaron con los de los estudios in vivo en rumiantes.20,21

Sin embargo, se necesita prudencia para extrapolar los resultados in vitro a las condiciones in vivo debido a que los metabolitos secundarios de las plantas pueden modificarse después de pasar por el tracto digestivo. Esto es así particularmente en el rumen, donde las cumarinas sufren degradación bacteriana.22 Además de esto, deben tenerse en cuenta los mecanismos adaptativos especiales que desarrollan los animales.

La presencia de Streptococcus caprinus en el rumen de los ovinos y la secreción de saliva con abundante prolina son las principales adaptaciones que experimentaron los ovinos, por eso las plantas ricas en cumarinas son parte de la dieta de estos animales.23 Por otra parte, la toxicidad de las cumarinas no puede ser evaluada in vitro. Se sabe que las concentraciones de cumarinas entre bajas y moderadas (3-6 % en base a materia seca) tienen efectos positivos en la fisiología del hospedador, en el crecimiento y en la producción de lana y leche,24 mientras que en concentraciones altas (7-8 % en base a materia seca) reducen la ganancia de peso y la productividad de los animales, incluso pueden causarle la muerte.25

Por ello, una vez identificadas las especies de plantas con mayor efecto antihelmíntico mediante estudios in vitro, es necesario validar estos resultados con estudios in vivo.

Se llegó a la conclusión de que, en general, los extractos acuosos evaluados redujeron la migración de las larvas de los parásitos gastrointestinales de los ovinos. Las plantas que mostraron mayor inhibición de la migración larval contra estas especies de nematodos fueron C. ambrosioides y M. azadarach. El extracto de semillas de C. papaya no mostró un considerable porcentaje de inhibición de la migración larvaria. Estos resultados in vitro indican la existencia de propiedades antihelmínticas asociadas a algunas de las especies de las plantas evaluadas. Para confirmar estos resultados in vitro es necesario realizar estudios in vivo con dichas plantas.


Conflicto de intereses

Los autores expresan que no existe conflicto de intereses.

 

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Recibido: 11/01/2018
Aprobado: 11/02/2019

 

 

Carlos Eduardo Rodríguez-Molano. Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia. Correo electrónico: carlos.rodriguez@uptc.edu.co





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